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双水相萃取法测定灯盏花及提取物中灯盏花乙素(2)
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摘要：灯盏花乙素属于黄酮类化合物，分子中含有多个酚羟基和羰基，在pH较高和较低情况下，会发生酚羟基氢离子的电离和羰基的质子化，最终变成大极性离子
灯盏花乙素属于黄酮类化合物，分子中含有多个酚羟基和羰基，在pH较高和较低情况下，会发生酚羟基氢离子的电离和羰基的质子化，最终变成大极性离子。由于酚羟基的存在，灯盏花乙素相当于多元弱酸，一般会以质子化阳离子形态、分子形态和失质子化阴离子形态存在。根据相似相溶的原理，弱极性的分子形态灯盏花乙素易富集于乙醇相中，而大极性离子形态的灯盏花乙素则易于分配在水相中。因此，溶液酸碱度对灯盏花乙素的分配起很重要作用。分子形态的灯盏花乙素结构上的酚羟基和羰基与乙醇羟基之间的氢键也非常有利于提高灯盏花乙素的分配比，使其易富集于乙醇中。
2.2双水相体系的优化
2.2.1 不同盐对灯盏花乙素萃取率和相比的影响 乙醇能与水无限互溶，为使其分相，分别加入NaCl、(NH4)2SO4、Na2CO3、Na3PO4和Na2SO4几种盐与乙醇形成双水相体系。结果表明，只有(NH4)2SO4、Na2CO3和Na2SO4可以与乙醇形成双水相体系，但其对灯盏花乙素萃取率存在明显差异。加入相同的盐量，相比也存在差异。如图1所示，从中可以看出(NH4)2SO4对灯盏花乙素的萃取效果最好，并且使用(NH4)2SO4时乙醇相比更接近1。因此，研究中选择(NH4)2SO4作为分相盐。
图1 盐种类对萃取率的影响Fig.1 Effect of the types of salt on extraction efficiency of scutellarin
2.2.2 (NH4)2SO4含量对灯盏花乙素萃取率的影响 乙醇加入量为1.5 mL，保持其他实验条件不变，分别考察盐质量分数为5 %、8 %、10 %、15 %、20 %、25 %和30 %时对萃取率的影响。如图2所示，在盐质量分数小于8 %时，溶液无法形成双水相，当盐质量分数大于8 %时，随着盐质量分数的增加，萃取率逐渐增加，当(NH4)2SO4质量分数为25 %时萃取率最高为93.4 %。故研究中，确定(NH4)2SO4最优质量分数为25 %。
2.2.3 乙醇用量对灯盏花乙素萃取率的影响 分别考察了不同量的乙醇(0.5，1，1.5，2，2.5和3 mL)对灯盏花乙素萃取率的影响。由图3可见，当乙醇的用量为0.5、1 和1.5 mL时，萃取率即能达到90 %以上，此时相比Rv均较接近于1。当乙醇用量逐渐增加时，萃取率反而有所下降，究其原因是，在盐的质量分数一定时，部分乙醇溶解于盐相之中，导致未达最优相比，萃取率降低。考虑到乙醇量较小时所使用盐的量较大，故选择1.5 mL即为最优的乙醇用量。
图2 (NH4)2SO4质量分数对萃取率的影响Fig.2 Effect of (NH4)2SO4mass fraction on extraction efficiency of scutellarin
图3 乙醇用量对萃取率的影响Fig.3 Effect of the volume of ethanol on extraction efficiency of scutellarin
2.2.4 pH对灯盏花乙素萃取率的影响 在保持乙醇的用量为1.5 mL和盐的质量分数为25 %的条件下，调节体系的pH值在3～9，如图4所示。pH值为3～6时，灯盏花乙素的萃取率逐渐升高，pH值为6时，萃取率最高为94.3 %。当pH值大于7时，灯盏花乙素的萃取率较低。究其原因灯盏花乙素在弱酸性条件下呈分子状态，极性较小，在乙醇中的分配比更大。当溶液pH值较低时灯盏花乙素上的羰基会被质子化，pH值较高时氢离子又会被电离，都会形成极性较大的分子，分配比较低[14-15]。故选择pH=6.0为最优条件。
2.3样品分析
2.3.1 线性范围 取适量灯盏花乙素对照品，加入甲醇溶解，使浓度为0.2 mg/mL，即得对照品储备液。取对照品溶液，分别稀释至0.1，0.075，0.050，0.020，0.010 和0.005 mg/mL，按照上述相同的色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，即得回归方程：Y=，r=0.9989，线性范围：0.005～0.1 mg/mL。
2.3.2 样品测定 在已优化的双水相萃取条件下，采用本方法萃取灯盏花粗提液中的灯盏花乙素，然后进HPLC 检测灯盏花乙素含量，色谱图如图5所示，结果见表1。试验中对灯盏花粗提液进行2个水平的加标回收实验(n=6)，检测结果见表2。
由色谱图可见，经双水相萃取之后，可以进一步降低灯盏花中其它杂质的干扰，灯盏花乙素的色谱峰峰型也变的更好，与相近峰的干扰也较小。究其原因是乙醇-盐双水相体系能显著去除粗提液中极性物质分子和大分子杂质的干扰，在一定程度上纯化灯盏花乙素。由表1和图6可知，经过双水相萃取之后，灯盏花中灯盏花乙素已经被富集到乙醇相中，该方法萃取率达到94.2 %，并且双水相体系萃取后的检测结果为2.46 %，与2015版药典检测结果灯盏花乙素含量2.43 %更为接近。从表2可知，该方法准确性较好，能有效分离富集灯盏花粗提液中的灯盏花乙素，完全满足对灯盏花样品中灯盏花乙素含量的测定。
文章来源：《绿色环保建材》 网址: http://www.lshbjczz.cn/qikandaodu/2021/0312/702.html
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