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双水相萃取法测定灯盏花及提取物中灯盏花乙素
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摘要：【研究意义】灯盏花主要产于云南、广西、贵州等地，又称灯盏细心，为菊科植物短葶飞蓬的干燥全草，其主要成分为黄酮类化合物，有效成分为灯盏花乙素[1]。具有清除活性氧自由基
【研究意义】灯盏花主要产于云南、广西、贵州等地，又称灯盏细心，为菊科植物短葶飞蓬的干燥全草，其主要成分为黄酮类化合物，有效成分为灯盏花乙素[1]。具有清除活性氧自由基、溶解血栓、增强脑部血液流动和降低血管阻力等作用[2]，临床上多用于治疗心脑血管等疾病[3～6]。作为国家重点开发的中药材，灯盏花在云南丽江、红河等地实现大规模种植。【前人研究进展】目前，灯盏花中有效成分——灯盏花乙素的提取主要为水浸提法、超声波提取法、溶剂回流法等[7]。《中华人民共和国药典》2015版药典中即采用溶剂回流的方法提取灯盏花乙素，而后再利用HPLC法测定灯盏花中灯盏花乙素含量。但使用双水相萃取技术提取灯盏花中灯盏花乙素的报道很少。【本研究切入点】双水相萃取是一种基于液-液萃取的技术，其以操作简单、萃取条件温和易于放大等一系列优点，已经广泛应用于天然产物分离、生物提取等领域[8-9]。近年来，有报道使用一种水溶性低级醇-盐双水相体系分离技术提取分离药用植物中的有效成分，克服传统双水相萃取中因聚合物粘度大造成的不易收集，不易回收等缺点[10-13]。【拟解决的关键问题】通过以无毒无害的低级醇(乙醇)与盐形成双水相体系，将其应用于灯盏花中灯盏花乙素的提取分离。
1材料与方法
1.1实验材料和试剂
灯盏花药材由云南易思高生物科技有限公司提供；灯盏花乙素对照品购自上海麦克林生化科技有限公司；乙醇、(NH4)2SO4、H3PO4、NaCl、Na2CO3、Na2SO4Na3PO4和NaOH均为分析纯，甲醇为色谱纯、水为超纯水。
1.2实验仪器与色谱条件
KQ100DB型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；pH计(雷磁PHS-3C)；FA1004型万分之一分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；德国IKA Lab Dancer小舞灵漩涡混匀器。
Agilent 1260高效液相色谱仪(配备四元泵、VWD检测器、自动进样器、柱温箱)，色谱条件：Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液(40∶60)，检测波长为335 nm，流速为1 mL/min，柱温箱为25 ℃。
1.3实验方法
1.3.1 灯盏花粗提液的制备 将干燥后的灯盏花全草打粉至80目，取细粉0.1 g(精密称定)，将其置于25 mL具塞离心管中，加入10 mL甲醇，密塞，称重，超声1 h，放冷称重，甲醇补足重量。然后于4000 r/min离心10 min，取上清液，加水稀释至50 mL，作为灯盏花乙素粗提液。
1.3.2 双水相萃取分离灯盏花乙素 考虑双水相体系的性质，选择乙醇作为提取溶剂。取10 mL灯盏花乙素粗提液至15 mL 离心管中，加入一定量的(NH4)2SO4和无水乙醇，调pH值至6，涡旋1 min，使其充分混合。然后以4000 r/min离心5 min，促使其分相。下层即为盐相，上层为乙醇萃取相。读取上下层体积之后(相比=萃取相体积/水相体积)，用注射器移除下层水相。为防止萃取相中存在的盐对高效液相色谱仪造成腐蚀，萃取相中加甲醇0.5 mL进行脱盐处理，最后甲醇定容至2 mL，过0.45 μm有机相滤膜之后，取10 μl进HPLC进行分析。
1.3.3 灯盏花乙素含量测定 采用HPLC法测定灯盏花粗提液中灯盏花乙素含量。根据灯盏花乙素标准曲线计算其浓度，然后再按下式计算灯盏花乙素含量(%)：
式中，R为萃取效率(%)；Cu为灯盏花乙素在萃取相中的浓度(mg/mL)；Vu为萃取相的体积(mL)；m为称取的灯盏花粉末的质量(mg)。
2结果与分析
2.1双水相体系的形成与灯盏花乙素的萃取过程
所使用的乙醇能与水完全互溶，通过乙醇-水体系统加入(NH4)2SO4，利用盐析作用，促进乙醇与水相的分离。双水相体系的形成是(NH4)2SO4与乙醇争夺水分子的过程，随着盐浓度的增大，盐会夺取水分子，促使乙醇从盐相析出，使水分子离开乙醇相，最终出现分相，上层为乙醇相，下层为盐水相。为研究不同条件下，双水相体系中乙醇相的变化，通过以下公式计算相比Rv∶Rv=Vend∶Vin，式中,Vend为乙醇相的体积，Vin为加入的乙醇的初始体积。当Rv趋近于1时表示乙醇与水完全分离。
当初始乙醇的量较小时，促使溶液分相所需要加入的(NH4)2SO4量比较大；当初始乙醇的量较大时，促使溶液分相所需要加入的(NH4)2SO4量会相对减少，同时，相比Rv>1，说明双水相形成过程中有部分水进入乙醇相，导致溶液的分相能力变差。这主要是乙醇的水化能力较大，初始的量较大时，会影响其分相能力，不利于灯盏花乙素的富集。此外，无机盐的盐析能力越大，分相能力也越强。故选择合适的盐和加入合适量的乙醇，有助于双水相体系的形成。
文章来源：《绿色环保建材》 网址: http://www.lshbjczz.cn/qikandaodu/2021/0312/702.html
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